糟粕醋的加工是一個(gè)復(fù)雜的發(fā)酵過(guò)程，涉及米糟或面糟的制備、發(fā)酵和陳釀等多個(gè)階段[9],其主要的原料為大米或面粉，而糟粕是前一批醋制作過(guò)程中留下的渣滓，含有有益微生物，這些原料在制作前需要經(jīng)過(guò)清洗和處理，確保無(wú)雜質(zhì)[10]。大米或面粉與水混合，經(jīng)過(guò)蒸煮后制成糟粕，糟粕與水混合，形成發(fā)酵液，這一混合物暴露于空氣中，使空氣中的自然微生物和醋酸菌能夠進(jìn)入，并將酒精轉(zhuǎn)化成醋酸，時(shí)間長(zhǎng)短取決于所用的發(fā)酵方法和具體的工藝[11][12],發(fā)酵完成時(shí)，醋液被留在容器中進(jìn)行陳釀，經(jīng)過(guò)陳釀的糟粕醋風(fēng)味變得更加濃郁，且口感更加豐富[13]。

糟粕醋是一種傳統(tǒng)食品，其營(yíng)養(yǎng)成分主要來(lái)源于原料以及發(fā)酵過(guò)程中微生物產(chǎn)生的代謝物。醋酸是糟粕醋的主要成分，在酵母和細(xì)菌作用下將酒精轉(zhuǎn)化成醋酸，賦予醋獨(dú)特的酸味。在發(fā)酵過(guò)程中，酵母和細(xì)菌會(huì)分解蛋白質(zhì)[14][15],生成氨基酸，氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本組成部分，對(duì)于身體的生長(zhǎng)和維護(hù)有著關(guān)鍵作用。由于原料和微生物的復(fù)雜作用，糟粕醋中還含有多酚類(lèi)化合物，多酚是一類(lèi)具有抗氧化作用的物質(zhì)，能夠減少機(jī)體中的自由基[16]。

研究糟粕醋中微生物多樣性具有重要意義，因?yàn)槲⑸镌诎l(fā)酵過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，直接影響醋的品質(zhì)、口感和營(yíng)養(yǎng)特性。不同種類(lèi)的微生物會(huì)產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，包括各種有機(jī)酸、醇類(lèi)和酮類(lèi)。微生物的多樣性直接影響醋的風(fēng)味、口感和香氣，研究微生物的種類(lèi)和數(shù)量有助于理解醋品質(zhì)的形成機(jī)制。通過(guò)深入研究糟粕醋中微生物的多樣性，有助于維持傳統(tǒng)工藝特色，確保醋的質(zhì)量和口感。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

糟粕醋、測(cè)序試劑盒、凝膠回收試劑盒。

1.2 試驗(yàn)儀器

微型食品熱量檢測(cè)儀、電泳儀、PCR儀、熒光定量系統(tǒng)、分光光度計(jì)、二代高通量測(cè)序儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糟粕醋加工工藝

挑選糯米→洗米→蒸米→冷卻→拌曲→發(fā)酵→過(guò)濾→酒槽渣→發(fā)酵→調(diào)味并制成糟粕醋。

糟粕醋制作步驟：挑選無(wú)蟲(chóng)害、優(yōu)質(zhì)的糯米，將糯米淘洗后用水浸泡至可以用手碾碎為佳，將泡好的糯米放于蒸鍋中蒸20 min, 直到糯米外硬內(nèi)軟，以顆粒飽滿(mǎn)無(wú)白芯為好；之后將蒸好的糯米攤開(kāi)，待其冷卻至室溫后，添加適量的酒曲和酵母，用4層紗布將其過(guò)濾，獲得酒槽渣液，之后在酒槽液中加入水和醋酸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，并獲得醋酸，然后加入適量的調(diào)味料，獲得糟粕醋。

1.3.2 樣本采集

將獲取的糟粕醋放于無(wú)菌三角瓶中，每隔1 d取一次樣，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行取樣，持續(xù)取樣7 d, 分別將樣品標(biāo)記為1,2,3,4,5,6,7。

1.3.3 基因組提取

用移液槍吸取5 mL樣品后用過(guò)濾膜將其過(guò)濾，再根據(jù)基因組提取試劑盒的操作流程進(jìn)行操作，將提取的DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3.4 糟粕醋中的理化因子分析

每隔1 d對(duì)樣品的pH值、碳水化合物含量和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 糟粕醋中細(xì)菌的多樣性分析

2.1.1 糟粕醋中細(xì)菌的Alpha多樣性分析

通過(guò)16S rDNA 分析，一共獲得了130 231 231 bp的數(shù)據(jù)，聚類(lèi)的有457個(gè)OTU,一共拼接了346 756個(gè)數(shù)據(jù)片段，所有基因的平均片段為453 bp。糟粕醋中的細(xì)菌多樣性分析見(jiàn)表1,用Simpson(指數(shù)值越大，說(shuō)明群落的多樣性越低)、Sobs(觀察到的生物種數(shù))、Shannon(用于表示群落的豐富度和均勻度)、Chao(用于估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的指數(shù))、Ace(用于估計(jì)群落中含有OTU數(shù)目的指數(shù))和Coverage(各樣品文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越高說(shuō)明樣品中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率越低)對(duì)糟粕醋中細(xì)菌的多樣性進(jìn)行分析。

由表1可知，樣品1,2,3的Chao值、Shannon值和Ace值明顯高于樣品4,5,6,7,說(shuō)明樣品1,2,3中的細(xì)菌多樣性較高；樣品4,5之間的Chao值、Shannon值和Ace值較接近，說(shuō)明樣品4,5中細(xì)菌群落的組成結(jié)構(gòu)相似度較高。7個(gè)樣品的Coverage均接近于1,說(shuō)明檢測(cè)值的覆蓋率較高，符合細(xì)菌多樣性要求分析。Shannon值越高，表示細(xì)菌群落的多樣性越豐富，分析的7個(gè)樣品中，樣品1,2的Shannon值比其他樣品高，說(shuō)明樣品1,2中的細(xì)菌群落最豐富。

2.1.2 細(xì)菌群落的熱圖

將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，一共獲得20個(gè)門(mén)、50個(gè)綱、110個(gè)目、193科、326個(gè)屬和457個(gè)種。在屬水平上，基于樣品之間的豐度相似性進(jìn)行聚類(lèi)，獲得樣品豐度較大的45個(gè)細(xì)菌屬，見(jiàn)圖1。

由圖1可知，顏色的深淺及相似性表示樣品中細(xì)菌的豐度和差異。樣品1和樣品2中細(xì)菌的顏色偏淺且較接近，說(shuō)明樣品1和樣品2中細(xì)菌較多且豐度均勻，最具有優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌屬為Corynebacterium和Brevibacterium。樣品3中的細(xì)菌群落多樣性有所降低，且有新優(yōu)勢(shì)屬出現(xiàn)，分別為Prevotella、Clostridium和Enterobacter,這幾個(gè)屬的細(xì)菌僅在C樣品中表現(xiàn)出較大豐度。樣品4,5,6,7中的細(xì)菌多樣性相似度較高，并且細(xì)菌Lactobacillus是4個(gè)樣品中最具有優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌屬，細(xì)菌Lactobacillus具有產(chǎn)酸功能，使得糟粕醋中產(chǎn)酸量增加，pH值下降。隨著糟粕醋放置時(shí)間的延長(zhǎng)，醋中的細(xì)菌豐富度開(kāi)始降低，優(yōu)勢(shì)菌集中，多樣性降低。

2.1.3 細(xì)菌菌落與理化因子的關(guān)系分析

理化因子的pH值、蛋白質(zhì)含量和碳水化合物含量見(jiàn)表2,通過(guò)生信平臺(tái)PCA分析糟粕醋發(fā)酵時(shí)間與其品質(zhì)的關(guān)系。隨著糟粕醋發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值逐漸降低，含酸量逐漸增多。糟粕醋中的蛋白質(zhì)含量先減少后增多，說(shuō)明糟粕醋中的蛋白質(zhì)含量與糟粕醋發(fā)酵時(shí)間相關(guān)。

續(xù) 表

2.1.4 細(xì)菌的COG功能分析

將測(cè)序獲得的16S rDNA進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，獲得COG功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)圖。糟粕醋在細(xì)菌屬水平上的COG功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)圖見(jiàn)圖2。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，糟粕醋中的功能基因較穩(wěn)定，功能基因中的重組、修復(fù)、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝相對(duì)功能變化影響較明顯。

2.2糟粕醋中真菌的多樣性分析

2.2.1 糟粕醋中真菌的Alpha多樣性分析

糟粕醋中真菌的Alpha多樣性分析見(jiàn)表3。

由表3可知，樣品2和樣品5的Ace值和Chao值遠(yuǎn)高于其他樣品，兩個(gè)樣品的Ace值和Chao值較接近，說(shuō)明兩個(gè)樣品中的真菌相似度較高；樣品4和樣品7的Shannon值較接近，且高于其他樣品，說(shuō)明樣品4和樣品7的真菌多樣性較豐富；7份樣品的Coverage均接近1,覆蓋率較高，測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值接近。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，糟粕醋中真菌豐度和群落隨之變化。

2.2.2 糟粕醋真菌群落的結(jié)構(gòu)組成

將真菌測(cè)序的結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，糟粕醋中共包括3個(gè)門(mén)、7個(gè)綱、12個(gè)目、19個(gè)科和25個(gè)屬的真菌。在屬水平上，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中真菌多樣性變化并不明顯，糟粕醋中真菌群落的熱圖見(jiàn)圖3。

圖3中的深淺變化為糟粕醋自然放置過(guò)程中真菌群落組成的差異。樣品1,2,3中的真菌多樣性相似度較高，聚成一個(gè)支系，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，真菌屬內(nèi)物種增加較明顯，其中Kazachstania、Saccharomyces、Neocosmospora和Setophoma物種數(shù)最突出，3個(gè)樣品中的優(yōu)勢(shì)屬為Issatchenkia;而樣品4,5,6,7聚成另一個(gè)支系。另外，糟粕醋中含有的大量碳水化合物在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)被酵母菌分解成碳水化合物，進(jìn)而產(chǎn)生更多的酚類(lèi)和酯類(lèi)化合物。

2.2.3 真菌菌落與理化因子的關(guān)系分析

利用生信平臺(tái)對(duì)糟粕醋中的真菌多樣性和理化因子之間的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，橫坐標(biāo)PC1的方差貢獻(xiàn)值為31.60%,縱坐標(biāo)PC2的方差貢獻(xiàn)值為19.79%,通過(guò)比較分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)樣品的向量投影差距較大，說(shuō)明7個(gè)樣品中的真菌差異性較明顯。樣品2,5,7距離樣品的投影距離較小，說(shuō)明3個(gè)樣品受pH值、蛋白質(zhì)含量和碳水化合物含量的影響較大；樣品1,3,6距離pH值、蛋白質(zhì)含量和碳水化合物含量較遠(yuǎn)，說(shuō)明這3個(gè)樣品受蛋白質(zhì)含量和碳水化合物含量的影響較小。

3 糟粕醋冷鏈運(yùn)輸過(guò)程中的問(wèn)題分析

糟粕醋是一種傳統(tǒng)的食材，在加工和運(yùn)輸過(guò)程中需要嚴(yán)格控制溫度和濕度，以確保產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。冷鏈運(yùn)輸是一種專(zhuān)門(mén)用于運(yùn)輸溫度敏感商品的物流方式，然而，在糟粕醋的冷鏈運(yùn)輸過(guò)程中，仍然存在一些問(wèn)題需要認(rèn)真分析和解決。

3.1 運(yùn)輸過(guò)程中溫度不夠穩(wěn)定

首先，溫度控制是冷鏈運(yùn)輸?shù)暮诵膯?wèn)題之一。糟粕醋在運(yùn)輸過(guò)程中需要保持相對(duì)穩(wěn)定的低溫環(huán)境，防止發(fā)酵或腐敗。然而，在運(yùn)輸途中，由于氣候變化、設(shè)備故障或不當(dāng)操作，溫度波動(dòng)情況隨時(shí)發(fā)生，溫度波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降，甚至對(duì)消費(fèi)者健康構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 濕度控制和運(yùn)輸設(shè)備與設(shè)施的不足

濕度控制也是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。糟粕醋在濕度較高的環(huán)境中容易受潮，影響品質(zhì)。在冷鏈運(yùn)輸中，由于不同地區(qū)濕度差異以及包裝材料的特性，濕度控制非常困難。如果濕度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致糟粕醋發(fā)霉、變質(zhì)，嚴(yán)重的會(huì)影響產(chǎn)品的安全性。

冷鏈運(yùn)輸需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備和設(shè)施來(lái)確保溫、濕度的精確控制，但在一些地區(qū)或小型企業(yè)中，可能缺乏這些必要設(shè)備，這會(huì)導(dǎo)致糟粕醋在運(yùn)輸過(guò)程中無(wú)法得到適當(dāng)保護(hù)，從而降低產(chǎn)品的品質(zhì)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

4 糟粕醋冷鏈運(yùn)輸?shù)慕ㄗh

4.1 優(yōu)化冷鏈運(yùn)輸設(shè)備

投資先進(jìn)的冷鏈運(yùn)輸設(shè)備，包括溫度控制系統(tǒng)、濕度控制裝置和先進(jìn)的包裝技術(shù)。應(yīng)確保設(shè)備的可靠性和準(zhǔn)確性，以最大程度地保護(hù)糟粕醋的質(zhì)量。

4.2 加強(qiáng)員工培訓(xùn)

對(duì)冷鏈運(yùn)輸人員進(jìn)行系統(tǒng)的培訓(xùn)，包括冷鏈運(yùn)輸知識(shí)、設(shè)備操作技能、應(yīng)急處理措施。應(yīng)提高員工的專(zhuān)業(yè)水平，減少人為因素對(duì)運(yùn)輸過(guò)程的影響。

4.3 設(shè)立監(jiān)控系統(tǒng)

在運(yùn)輸車(chē)輛和倉(cāng)儲(chǔ)設(shè)施中安裝實(shí)時(shí)監(jiān)控系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)溫、濕度的變化。當(dāng)溫、濕度超出安全范圍時(shí)，系統(tǒng)應(yīng)該能夠自動(dòng)報(bào)警，以便及時(shí)采取措施，防止質(zhì)量問(wèn)題發(fā)生。

4.4 建立合作關(guān)系和強(qiáng)化溯源體系

與專(zhuān)業(yè)的冷鏈物流公司建立合作關(guān)系，共享資源和經(jīng)驗(yàn)，這樣能夠提高整個(gè)冷鏈運(yùn)輸體系的可靠性和專(zhuān)業(yè)性。在運(yùn)輸過(guò)程中建立完善的糟粕醋追溯體系，記錄溫濕度變化、操作人員等關(guān)鍵信息，以便在發(fā)生問(wèn)題時(shí)能夠快速定位并采取措施。

5 小結(jié)

本研究利用Illumina技術(shù)對(duì)糟粕醋中的真菌和細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，貯藏前3 d, 糟粕醋中的細(xì)菌多樣性變化不明顯，其中前3 d糟粕醋中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Corynebacterium、Brevibacterium、Prevotella、Clostridium和Enterobacter;當(dāng)貯藏時(shí)間大于4 d時(shí)，糟粕醋中的細(xì)菌多樣性發(fā)生了明顯變化，Lactobacillus成為糟粕醋中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群。

在糟粕醋的真菌多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)真菌屬分別為Saccharomyces、Kazachstania和Issatchenkia,這些真菌能夠發(fā)酵分解糟粕醋中的醇類(lèi)和蛋白質(zhì)類(lèi)，隨著貯藏時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，糟粕醋中的酸性物質(zhì)不斷增加，使得糟粕醋的風(fēng)味變酸，無(wú)法正常食用。